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不同来源人间充质干细胞的分离及培养

文章作者:微风再境 / 发布时间:2018-01-16

原文

Dolly Mushahary,et al.Isolation, Cultivation, and Characterization of Human Mesenchymal Stem Cells.

—综述:人间充质干细胞的分离、培养和鉴别

 

总结文章中关于不同来源人间充质干细胞的分离及培养:

 

间充质干细胞的传统来源是骨髓,但是骨髓虽然富含造血干细胞,间充质干细胞量却很少,而且采集过程又很痛苦,所以临床和科研应用就受到限制。幸好之后各种组织中都发现了MSC,而且脂肪组织和脐带中的MSC还格外丰富。

 

国际细胞治疗协会规定了间充质干细胞的鉴定方法:

1. 自我更新能力

2.软骨、成骨和脂肪的多向分化潜力。

3.一系列表面标记物表达:分化簇 CD73CD90CD105,不表达CD14CD34CD45HLA-DR

 

不同来源的人间充质干细胞

人类骨髓来源间充质干细胞

新生儿脐带来源间充质干细胞

新生儿脐带血来源间充质干细胞

人类脐带华通氏胶来源间充质干细胞

人类脂肪来源间充质干细胞

人类羊水来源间充质干细胞

人类牙髓来源间充质干细胞

人类皮肤来源间充质干细胞

新生儿胎盘来源间充质干细胞

人类唾液腺来源间充质干细胞

人类滑膜来源间充质干细胞

 

人间充质干细胞的分离

间充质干细胞的分离一般采用贴壁细胞的分离方法:

切组织块—酶法消化—塑料表面生长

 

具体到不同来源的人间充质干细胞主要可分为:组织块培养法和酶法分离

 

组织块培养法:

缺点:机械操作可能会伤害细胞。

优点:异质性低,扩增率和细胞活性高。扩增时间短,能释放细胞因子,高产基质细胞。

 

所以最好的MSC分离方法是结合组织块培养和酶法分离。

 

脐带来源间充质干细胞的分离

人脐带间充质干细胞虽然是成体干细胞,但是没有表面标志物CD73, CD90CD105,还表达胚胎干细胞表面标志物 Tra-160, Tra-181, stage-specific embryonic antigen-1 (SSEA-1), SSEA-4alkaline phosphatase。多能干性相比骨髓和脂肪来源的MSC更加高。

 

脐带的不同部分都能获得MSC:脐带血,脐带静脉下内皮组织和华通氏胶。

目前,脐带MSC的两种分离方法,组织块培养法和酶法分离,因为脐带来源不一致等影响,还不能明确优劣。

 

脂肪组织间充质干细胞的分离

脂肪来源于外科手术废弃,获得比较容易,而且富含间充质干细胞:MSC产量是骨髓的2500倍。

 

它的分离方法主要是酶法分离:

1. 得到MSCPBS清洗—胶原酶消化—离心沉淀SVF(基质血管部分)—红细胞裂解—过滤去渣。

2. 塑料器皿过夜培养,洗涤去除没有贴壁的细胞。

酶法改进:酶类型和浓度,消化时间,胶原酶抑制缓冲液,离心速度,过滤孔径。

 

不同来源人间充质干细胞的分离及培养

1 人类骨髓来源间充质干细胞

人类骨髓来源间充质干细胞分离

骨髓经Ficoll密度梯度离心,获得单个核细胞层,进一步获得间充质干细胞。

人类骨髓来源间充质干细胞原代及传代培养

Knock out DMEMDMEM+10%FBS

 

2 新生儿脐带来源间充质干细胞 新生儿脐带血来源间充质干细胞

新生儿脐带来源间充质干细胞 新生儿脐带血来源间充质干细胞分离

Ficoll-Hypaque 密度梯度离心,酶消化法(0.25% 胰蛋白酶-EDTA),组织块培养法

新生儿脐带来源间充质干细胞 新生儿脐带血来源间充质干细胞原代及传代培养

DMEM+10%FBS10%FCSMSCGM+10%FCS

 

3人类脐带华通氏胶来源间充质干细胞

人类脐带华通氏胶来源间充质干细胞分离

组织块培养法, 酶消化法 (0.1% 胶原酶II,1 mg/ml 胶原酶B+胰蛋白酶, 胶原酶 +hyaluronidase +胰蛋白酶,胰蛋白酶-EDTA, 0.26% 胶原酶I+ 0.07% hyaluronidase+0.125% 胰蛋白酶)

人类脐带华通氏胶来源间充质干细胞原代及传代培养

DMEM/DMEM-F12 + 10% FBS

 

4 人类脂肪来源间充质干细胞

人类脂肪来源间充质干细胞分离

酶消化法(1.5 mg/ml 胶原酶 I, 1 mg/ml 胶原酶-I in 0.1% BSA)

人类脂肪来源间充质干细胞原代及传代培养

DMEM-Low Glucose+MCDB201+ 2% FCS,DMEM+ 20% FBS,MesenproRS

 

5 人类羊水来源间充质干细胞

人类羊水来源间充质干细胞分离

密度梯度离心,酶消化法 (0.25% 胰蛋白酶 +1.2 units/ml of dispase + 2 mg/ml 胶原酶I

人类羊水来源间充质干细胞原代及传代培养

a-MEM + 20% FBS, DMEMF12 + 10% FBS, high glucose DMEM + 20% hESC-defined FBS, KSR-based 培养基

 

6 人类牙髓来源间充质干细胞

人类牙髓来源间充质干细胞分离

酶法 (387.1 U/+mg 胶原酶+ 0.70 U/mg dispase II)

人类牙髓来源间充质干细胞原代及传代培养

D-MEM-F12, a-MEM + 2% FCS

 

7 人类皮肤来源间充质干细胞

人类皮肤来源间充质干细胞分离

酶消化法 (0.6 U/ml dispase, 0.62 Wunsch U/ml Liberase Blendzyme 1,1.25 mg/ml 胶原酶 I)

人类皮肤来源间充质干细胞原代及传代培养

DMEM-F12 1 10/5/0.5% FBS, DMEM + 20% FBS

 

8 新生儿胎盘来源间充质干细胞

新生儿胎盘来源间充质干细胞分离

Ficoll 密度梯度离心, 酶消化法(1 mg/ml Dispase, 300 U/ml 胶原酶, 100 U/ml Hyalluronidase,

80 U/ml DNAse I, 0.25% 胰蛋白酶-EDTA)

新生儿胎盘来源间充质干细胞原代及传代培养

DMEM 低糖 + 20% FBS

 

9 人类唾液腺来源间充质干细胞

人类唾液腺来源间充质干细胞分离

酶消化 (1.67 mg/ml 胶原酶+ 1.33 mg/ml hyaluronidase, 1.67 mg/ml dispase; 5.01 mg/ml 胶原酶2 + 3.99 mg/ml hyaluronidase,33.4 mg/ml dispase)

人类唾液腺来源间充质干细胞原代及传代培养

DMEM + 10% FCS, DMEMF12 + 3% FBS

 

10 人类滑膜来源间充质干细胞

人类滑膜来源间充质干细胞分离

FicollPaque 密度梯度离心, 酶消化法 (3mg/ml 胶原酶V)

人类滑膜来源间充质干细胞原代及传代培养

a-MEM + 10% FBS, 20% FBS

 

虽然基础培养基添加FBS10-20%可以满足细胞生长所需高浓度细胞生长和贴壁因子及营养和生化成分因为血清是异源物,会有高批间差异,病原体污染风险和免疫反应。不适合用于临床治疗。间充质干细胞的培养趋势是采用成分确定、无血清的培养基。

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